CCK8试剂盒答疑解惑

CCK8试剂盒答疑解惑

在细胞实验中经常会遇到对细胞的增殖检测和毒性检测，以往常用MTT试剂盒进行检测。CCK-8试剂盒出现后，由于其更加简单便捷的操作和更加灵敏优越的检测效果引起了广泛的好评。但是似乎还有很多人对CCK-8试剂盒不是很了解，AbMole收到了很多小伙伴对于CCK-8试剂盒的提问，那我们今天就一起来聊聊关于CCK-8试剂盒的那些事儿吧。

产品简介

CCK-8试剂盒是Cell Counting Kit的简称，是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

其基本原理是：该试剂中含有WST-8（水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐），WST-8属于MTT的升级产品，在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(Formazan)，反应机制如下图所示。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。即生成甲臜颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

WST-8检测原理图

CCK-8法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

产品优点

相比较于以往的细胞增殖/毒性检测试剂，CCK-8优点在于：

使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；

CCK-8法能快速检测；

CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；

CCK-8法的重复性优于MTT 法；

CCK-8法对细胞毒性小；

CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

具体区别见下表：

使用说明

CCK-8使用其使用方法在增殖和毒性试验中有所区别：

细胞增殖试验：

1. 接种细胞悬液100 µl (2000个/孔)于96孔板，预先置于37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内培养。

2. 加入10μLCCK-8，由于每孔加入CCK-8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀，同时要注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。

3. 把培养板放培养箱内1-4小时。由于细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

4. 测定450nm吸光度，建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

细胞毒性试验：

1. 接种细胞悬液100 µl (5000个/孔)于96孔板，预先置于37℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内培养。

2. 加入不同浓度的毒性物质。

3. 37℃培养箱中培养，加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间。

4. 加入10ul CCK-8，由于每孔加入CCK-8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀，同时要注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。

5. 把培养板放培养箱内1-4小时。由于细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

6. 测定450nm吸光度，建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

注意事项

1由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、 水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

2本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应， 所以还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。

3如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

4用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

活力计算

细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0 加药)-A(空白)] ×100

A(加药)：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK-8 溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0 加药)：具有细胞、CCK-8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

除了以上这些，AbMole还有一些Tip送给大家：

培养板的选择

除96孔板外，24孔板、12孔板均可用于CCK-8检测，只是采用24孔板、12孔板CCK-8的用量较多，使用量仍为培养基体积的1/10。

减少CCK-8加样的误差

避免CCK-8在枪头和孔壁上的残留；

可在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。

制作标准曲线的方法

取已知细胞数量的细胞悬液加入到培养板中；

用培养基依次等比例稀释成一个系列浓度的细胞悬液；

细胞培养一段时间后加入CCK-8试剂孵育1-4小时；

酶标仪进行测定，以细胞数量为X轴，OD值为Y轴，就可以制作标准曲线。

CCK-8加入后最佳的检测时间

CCK-8试剂和细胞内的脱氢酶反应是一个循环反应，随着时间的增加，颜色不断加深，OD值也会不断增加，但细胞数量却没有变化；

一般情况下，建议在确定最佳的实验条件（合适的时间、合适的OD值）后，把加入CCK-8试剂后的培养时间固定下来，以后在同样的培养时间点进行检测。

终止CCK-8显色的几种方法（96孔板）

每孔加入10μl0.1M HCl溶液；

在显色反应后，将培养板放入4度冰箱内；

每孔加10μl1%（W/V）的SDS溶液；

注：反应停止后，应在24小时内测定。