利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换

利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换

利用重叠PCR实现乙肝表面抗原CTL表位的替换*王文敬1,黎诚耀1,李明松2

（1.南方医科大学生物技术学院，广州市510515；

2.南方医科大学南方医院消化科，广州市（510515）中图图书分类号R392文献标识A摘要：目的以磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)的CTL表位EYILSLEEL替换HBsAg中内源性CTL表位LLD，构建用于预防和治疗乙肝的DNA疫苗。方法以重组表面抗原基因pcHBsAg质粒为模板，应用重叠延伸PCR扩增出含EYILSLEEL表位的HBsAg基因GPC3/HBsAg，将其插入pBSSK+载体中，构建出pBSSK/GPC3载体。然后，利用DNA重组技术将其定向插入真核表达载体pcDNA3.1+中，将真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定，构建表达CTL表位EYILSLEEL的DNA疫苗。结果酶切和测序的结果显示序列无错配，获得了完整表达EYILSLEEL表位的真核质粒pcDNA3-GPC3/HBsAg。结论成功将EYILSLEEL表位替换HBsAg的内源性CTL表位，构建了pcDNA3-GPC3/HBsAg真核表达质粒，可作为DNA疫苗进行预防乙肝病毒免疫功能的研究，并为多拷贝GPC3-HBsAg多肽疫苗的制备奠定了基础。关键词表位替换；磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白；细胞毒T淋巴细胞表位；重叠延伸PCR ReplacingCTLepitopeofrecombinantHBsAgbySOEingPCRWANGWen-Jing1,LICheng-Yao1,LIMing-Song2（1SchoolofBiotechnology,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2Dept.ofgastroenterology,NanFangHospital,Guangzhou510515,China）AbstractObjectiveThispaperwastomakeaHBVvaccinebyreplacingCTLepitopeofHBsAgwithEYILSLEELofGPC3antigen.MethodsTheGPC3/HBsAgDNAwasamplifiedbySEOingPCRfrompcHBsAgplasmidandlinkedintopBSSK+vectortoconstructpBSSK/GPC3vector.pBSSK/GPC3vectorwasidentifiedbyPCR,doubledigestingandsequencing.ThenthefragmentwithGPC3CTLepitopeEYILSLEELwasobtainedbydoubledigestingtheplasmidpBSSK/GPC3andtheninsertedintopcDNA3.1+vector.ResultsSequencingiscorrect.EukaryoticexpressionvectorpcDNA-GPC3/HBsAgwasconstructedsuccessfully.ConclusionTheconstructionofeukaryoticexpressionvectorpcDNA-GPC3/HBsAgprovidedasolidexperimentalfoundationforfurtherstudiesontheGPC3-HBsAgmultiplepeptidesvaccineforHBVinfection.Keywords:epitopeshift;glypican-3;CTLepitope;SOEingPCRSOEing(genesplicingbyoverlapextension)，即重叠区扩增基因拼接法，是基于普通PCR技术衍生出的一种基因融合和定点突变的有效方法。众所周知，由于引物只需要与模板有效结合，尤其是5’端序列不必与模板完全配对，因此扩增引物的5’端可以添加一种甚至是两种酶切位点，以便于后期克隆。SOEing法正是利用这一特点，向两个独立基因掺入一段新的序列以达到两个基因出现一个重叠区的目的，3’端的结合使基因融合或定点突变得以实现[2，3]。名称引物序列替换序列5’引物WJFtacatccatgagcctggaggagctggtgtgccccctgatccccggcagc替换序列3’引物WJRctcctccgaggctcaggatgtactccaccagcaggaagatcaggcacagcpcHBsAg5’引物SAGWFggatccaaccatggagaacatcaccagcggcttcpcHBsAg3’引物SAGWRgaattctgcagatgtacacccacaggcagaagaag乙肝表面抗原（HBsAg）疫苗无需免疫佐剂即能诱导出高效而特异的细胞免疫和体液免疫。HBsAg具有减毒活病毒疫苗的免疫原性，而本身不能复制，所以无感染性。探索以特异性的外源基因插入，或以外源CTL表位替代HBsAg上特异性的内源CTL表位，在体内诱导出高效而特异的针对肿瘤的细胞免疫，目前正成为全球研究的热点。本文利用HBsAg这种新型载体，实现CTL表位替换，构建针对肝癌（HCC）等肿瘤病原体的DNA疫苗，使其成为一种安全、有效的生物治疗HCC的工具，为研制潜在的肝癌治疗性多肽疫苗提供实验依据。1 材料与方法1.1 材料 pcHBsAg和pBSSK+质粒由澳大利亚的Bob教授惠赠；DH5α菌种为本实验室保存，pcDNA3.1+真核表达载体购自Invitrogen公司。PCR反应体系（Elongase、dNTP等）和限制性内切酶NotI、SalI、EcoRI、BamHI及T4DNA连接酶购自NEB公司；引物由invitrogen公司合成。1.2 CTL表位替换原理 改进的乙肝表面抗原重组质粒（pcHBsAg）包含VLQ、IPQ、FLG、LLD、SIL等CTL表位。1.3 引物 以pcHBsAg中LLD表位为CTL表位替换的目标，设计一对引入EcoRI、BamHI酶切位点的引物，并且5’和3’端均包括EYILSLEEL表位序列，详见表1。表1引物序列1.4 SOEingPCR扩增PCR反应条件见表2。表2反应体系反应体系×1VolumeddH2O21l5×PCRBuffer8ldNTPs(10mM)1l模板DNA1l(100ng)引物1（10μM）4l引物2（10μM）4lElongase(Taq)1lTotalVolume40l1.4.1分别扩增包含EYILSLEEL表位的基因片段以构建好的pcHBsAg质粒DNA为模板，分别用引物对SAGWF/WJR和WJF/SAGWR进行2个PCR反应，分别得到片段PCR1和PCR2。1.4.2扩增含EYILSLEEL表位的HBsAg全基因片段用第一步得到的片段PCR1和PCR2作为模板，以引物对SAGWF/SAGWR进行PCR反应，得到PCR产物即为替换pcHBsAg的CTL表位LLD，表达EYILSLEEL表位的GPC3/HBsAg基因片段（基因拼接示意见图1）。1.5 将GPC3/HBsAg基因克隆至pBSSK+载体 将GPC3/HBsAg基因用酚/氯仿法抽提1次，用乙醇/醋酸钠沉淀。纯化的DNA用T4连接酶，按常规方法连至pBSSK+载体。具体操作参照pBSSK+vector说明书。转化DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选，挑取单克隆培养，抽提质粒，进行PCR鉴定、EcoRI、BamHI双酶切鉴定。鉴定正确的克隆pBSSK/GPC3用Plasmidmidi法抽提质粒后，送测序。1.6构建GPC3/HBsAg基因的表达载体将含有EYILSLEEL表位序列的pBSSK/GPC3载体和pcDNA3.1+载体分别用NotI+SalI双酶切，2%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，用T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，用50ng/L的氨卞抗性培养板筛选。挑取克隆，抽提得到pcDNA-GPC3/HBsAg质粒，进行PCR和酶切鉴定。图

1 HBsAg/GPC3基因拼接示意图Fig1 SchematicdepictionforprincipleofHBsAg/GPC3splicingbyoverlapextension

2 结果2.1PCR扩增以pcHBsAg质粒为模板，按1.4方法中描述的混合不同片段并退火延伸的产物作为模板，PCR扩增出含EYILSLEEL表位序列的重组GPC3/HBsAg基因（≈680bp）。2.2 酶切、测序将pBSSK/GPC3载体转化DH5α，挑克隆抽质粒，以其为模板PCR扩增出680bp的目的片段；用EcoRI、BamHI对pBSSK/GPC3质粒进行双酶切鉴定，证明序列插入正确。将酶切鉴定正确的质粒送测序，测序结果显示HBsAg基因中LLD表位序列位置已被EYILSLEEL序列替换，且原序列中无错配碱基。2.3 构建真核表达载体 用NotI+SalI双酶切pcDNA3.1+载体以及pBSSK/GPC3质粒，得到的GPC3/HBsAg基因片段插入pcDNA3.1+载体片段。连接物转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆培养，抽提质粒EcoRI酶切鉴定，目的片段约700bp，证明真核表达载体构建成功（图2）。M12345650图2双酶切鉴定结果M,Marker；1~4,pcDNA3.1-GPC3/HBsAg；5,negativecontrolvectorFig2Resultofdoubledigestion3讨论澳大利亚研究人员发现，在保留HBsAg有效的包装蛋白表位基础上，在HBsAg基因开放性阅读框架（ORF）上定位突变掉内源性CTL表位，并建立核酸内切酶酶切位点，构建的重组质粒pcDNA3.1-HBsAg（简写pcHBsAg）允许插入一个或多个外源表位，在部分保留HBsAg生物学和免疫学特性的基