樟树叶提取液的抑菌作用研究

樟树叶提取液的抑菌作用研究

樟树叶提取液的抑菌作用研究指导老师：赵微加成员：许昌炎姜康田禹齐曹加伟 实验背景在我们南通大学校园里，随处可见那郁郁葱葱的樟树矗立在校园两旁。春天到了，各种细菌引起的疾病也开始传播，于是有个想法便萌生了。既然樟树百虫不侵，那么它的叶子是否又有抗菌的功效。生物学上是对樟树如此定义的：樟树系樟科属的常绿乔木植物, 树叶中含芳香性挥发油、樟脑等, 具有祛风、除湿、止痛、杀虫之功效樟树叶生长量大, 全年可采, 为可再生资源。这给我们的研究提供了理论依据。 实验目的植物源杀菌剂是指某些植物中含有的抗菌物质或诱导产生的植物防卫素，它能杀死或有效抑制某些病原菌。植物体内的抗菌化合物是植物体产生的多种具有抗菌活性的次生代谢产物，是包含了生物碱类、类黄酮类、蛋白质类、有机酸类和酚类等的化合物。许多植物具有较强的抑菌活性，如茶子、花椒、某些红树以及蕨类植物等，它们既能抗真菌、又能抗细菌，可见植物源杀菌剂对靶标具有广谱性。目前，我国对于樟树在抗虫方面的研究较多，但对于其抗菌作用的研究甚少。因此，该研究旨在探讨樟树叶提取物的抗菌效果，为新型抗菌剂的研发提供参考。通过实验，获取樟树的提取液，并对其进行科学分析。选择些代表性的细菌做各种侵染实验以比较其对细菌的抑制作用。以樟树叶提取液为材料，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、康氏木霉为实验菌种，利用杯碟法测定樟树叶提取物对各实验菌种的抑菌效果，并比较各浓度提取液抑菌效果的浓度效应和时间效应。实验预期：樟树叶提取液是一种广谱性抗菌剂，且对革兰氏阳性菌的抑菌效果最佳。实验流程1.材料与方法1.

1 材 料*** 原材料： 樟树叶，在南通大学校园内采集。*** 试剂器材： 超净工作台、加热回流装置、水浴装置、恒温箱、蒸汽压力灭菌锅、培养箱以及常用实验室微生物培养器具。*** 试验菌种： 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、康氏木霉。由南通大学生命科学学院提供。***细菌培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。这是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和nacl其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而nacl提供无机盐。 真菌培养基：马丁氏培养基。该培养基是一种用分离真菌的选择性培养基，由葡萄糖、蛋白胨、kh2po4mgso4·7h2o、孟加拉红（玫瑰红，rose bengal）和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源；蛋白胨主要作为氮源；kh2po4、mgso4·7h2o作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。1.2 方 法*** 樟树叶提取液的提取： 将樟树叶洗净，在烘箱中45℃干燥，粉碎，然后用索式提取法，称取30 g植物材料，加入20倍量的提取溶剂丙酮，80℃左右索式回流提取8 h；然后采用蒸馏装置回收溶剂，直至溶剂呈浸膏状，即得到有效成分提取物。*** 菌体的扩大培养： 从冰箱中取出实验所需菌种，在常温下静止2~3 h激活菌种。在激活菌种期间配制菌种所需培养基。配制好之后将接种器具和培养基放入高压灭菌锅内灭菌

2 h，当灭菌完成后等待灭菌锅温度降低到97℃以下时取出，待培养基温度大约为60℃时，进入超净工作台进行接。接种完毕后放入常温箱内保存，这里所用的培养基为未加琼脂的液体培养基。*** 平板的配制： 平板配制和菌体扩大培养都使用相同成分的固体培养基。当培养基大约60℃时，在超净工作台上将配好的菌种（连带液体培养基）倒入平板中，再加入固体培养基混匀。在无菌操作台中将已灭菌的牛津杯（内直径6 mm）放入培养基中（每个平板中放入5只牛津杯，其中1只作为对照）。待培养基凝固后取出，使培养基出现镂空，以便放入樟树提取液进行观察。*** 放入樟树叶提取液： 实验共设4个樟树叶提取液浓度和1组对照。4个浓度分别为原液、80%液、 60%液、40%液。对照组则选用无菌水。分别将各种浓度的提取液和对照组的无菌水快速加入上一步骤中平板镂空的地方，以加满不溢为宜。此步骤在超净工作台中进行，在加入完毕后用保鲜膜将培养皿包好，防止杂菌侵入感染。然后将培养皿放入常温箱中保温培养。*** 数据记录： 分别在菌体培养的12 h和24 h时，进行抑菌圈的观察和记录。2．结果与分析各浓度的樟树叶提取物对实验中5种菌种，无论是原核微生物还是真核微生物均具有较强的抗菌作用（表1），这说明樟树叶提取物具有广谱抗菌活性。樟树叶提取液对各菌种的抑制效果具有明显的浓度效应和时间效应，即抑菌效果随着提取液浓度的降低而下降；随着抑菌时间的延长而增强，如提取液对5种菌种24 h的抑菌效果都明显大于12 h的抑菌效果。虽然提取液具有广谱抗菌活性，但对不同菌种的抑制作用存在差异。实验表明，其对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果最佳，对康氏木霉和酿酒酵母的抑制作用相对较弱，对大肠杆菌的抑菌效果最差。可见，提取液对于革氏阳性菌的抑制作用大于霉菌、酵母和革兰氏阴性菌（图1~5），但对其抑菌的机理还有待进强于大肠杆菌等革兰氏阴性菌以及霉菌和酵母。樟树叶提取液做为一种天然的抗菌活性物质，具有较好的安全性，能应用在食品生产及食品原料保藏等领域，同时也为新型抗生素的开发和研制提供了新的、有参考意义的信息，但对其深入的开发和应用还有待进一步的研究一步的研究。 应用价值传统抗生素的使用，不断产生诸多新问题，其中最突出的就是产生各式耐药菌株和变异株，这又迫使抗生素不断加快更新换代的速度。这种恶性循环要求科研工作者寻找新一代抗菌药。樟树叶提取液对食品常见污染菌，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、康氏木霉等均有较强的抑制作用，是一种广谱性抗菌剂。对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌的抑制效果明显。以樟树叶的提取液用于抗菌剂的研制，为我们提供一个新思路，同时也可避免这种恶性循环，值得大加尝试！ 实验所需器材汇总樟树叶， 超净工作台，加热回流装置，水浴装置，恒温箱，蒸汽压力灭菌锅，培养箱以及常用实验室微生物培养器具，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母、康氏木霉，牛肉膏蛋白胨培养基。 参考文献：

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